第二彈｜實驗證明低氧條件下的干細(xì)胞培養(yǎng)效果更好！
自2007年發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞重編程以來，已有數(shù)千篇論文研究如何將人類體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)。最初，研究涉及在天然人胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的4個基因：Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc（Lin28和Nanog），使用逆轉(zhuǎn)錄病毒等遺傳修飾方法遞送基因，并在非合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
之后的十幾年中，研究人員做出了許多改進(jìn)，包括：
?、儆貌桓淖兓蚪M的方法取代遺傳修飾方法，提高安全性；
?、谟梅寝D(zhuǎn)化家族成員L-Myc取代c-Myc腫瘤基因；
③加入小分子來提高重編程效率；
?、軆?yōu)化培養(yǎng)條件，如使用低氧濃度條件（4–5%）；
⑤使用臨床相關(guān)且成分明確的培養(yǎng)基和基質(zhì)。
在上一篇推文中，我們通過對比實驗證明，低氧濃度相比正常氧氣濃度可以提高人類體細(xì)胞多能重編程效率。
在本次實驗中，我們通過許多改進(jìn)措施，在CellXpert®C170i CO2培養(yǎng)箱中，以低氧條件成功對人包皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，并對單一熒光和可選多順反子Episomal載體進(jìn)行改進(jìn)。
在測試的生長培養(yǎng)基中，電穿孔成纖維細(xì)胞顯示出穩(wěn)定的細(xì)胞粘附和擴增，核型正常的iPSC集落能夠在成分明確的培養(yǎng)基中穩(wěn)定擴增，并能夠分化為神經(jīng)和心臟細(xì)胞系。
材料與方法
基于上一篇所提的人類包皮成纖維細(xì)胞重編程方案，我們對質(zhì)粒pERCv1進(jìn)行改進(jìn)，在EBNA-1基因盒上游加入一個PGK啟動子（pERCv2，圖3）。
采用5μg/ml玻連蛋白包被的培養(yǎng)皿，并與合成基質(zhì)預(yù)處理的耗材（Eppendorf FN1 advanced®培養(yǎng)皿）進(jìn)行對比。
一旦誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）集落出現(xiàn)在重編程培養(yǎng)基中，將其轉(zhuǎn)移至無動物源性低蛋白Protein hESC培養(yǎng)基中進(jìn)行擴增。
所有iPSC擴增和神經(jīng)元分化早期步驟均在6孔板上進(jìn)行，而免疫染色分析的細(xì)胞或最終分化為運動神經(jīng)元或心肌細(xì)胞的細(xì)胞則通過離心接種到24孔培養(yǎng)板上。
成纖維細(xì)胞重編程
將成纖維細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并接種到涂有合成（0.75×106個細(xì)胞，A/B）或生物基質(zhì)（1×106個細(xì)胞，C/D）的6孔板上，24小時后觀察涂布于合成和生物基質(zhì)上的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的紅色熒光。
盡管合成基質(zhì)上的細(xì)胞數(shù)量較少（0.75×106 VS 1×106），但細(xì)胞的存活率和擴增能力明顯增強。因此，在許多玻連蛋白平板培養(yǎng)物中未能觀察到重編程細(xì)胞。最早能夠在涂布后11天觀察到重編程發(fā)生。
在電穿孔和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)中，兩種處理的細(xì)胞以相似的方式培養(yǎng)。均勻分布的梭形成纖維細(xì)胞呈立方形，并形成未發(fā)育的集落。
11天后，在兩種類型的重編程處理中僅觀察到少量RFP，表明可能存在質(zhì)粒丟失（附加體）或表觀遺傳失活（慢病毒載體）。
雖然RFP信號在兩種處理下均顯著下調(diào)（B/D），但從小集落的出現(xiàn)（A/C）來看，這4個基因至少在第11天達(dá)到了成功重編程的閾值。這些小集落在3周內(nèi)形成了成熟集落。
低氧條件下iPSC的擴增和表征
圖5所示的不成熟集落在涂布后第21天至第30天產(chǎn)生了更多的成熟集落，并使用溫和的非酶法進(jìn)行傳代。
常規(guī)傳代3次后，觀察到在合成基質(zhì)（A/B與C/D）上培養(yǎng)的集落比玻連蛋白上培養(yǎng)的集落純度更高，非重編程成纖維細(xì)胞更少。
為了純化玻連蛋白培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行人工挑選集落，而在合成基質(zhì)上生長的iPSC數(shù)量超過了在非酶傳代過程中脫落的少量成纖維細(xì)胞。
傳代7次后，對合成基質(zhì)Episomal質(zhì)粒重編程細(xì)胞系進(jìn)行核型分析，結(jié)果正常。
將相似的培養(yǎng)物通過離心接種到24孔板上，進(jìn)行常規(guī)多能性或分化標(biāo)志物分析。
在第8代，培養(yǎng)物無明顯SSEA1（分化標(biāo)志物）表達(dá)，并穩(wěn)定表達(dá)SSEA4表面標(biāo)志物和Oct4轉(zhuǎn)錄因子。同樣，這些細(xì)胞共表達(dá)了Lin28細(xì)胞質(zhì)RNA結(jié)合蛋白、Nanog轉(zhuǎn)錄因子和Tra-1-60細(xì)胞表面標(biāo)志物。
iPSC向神經(jīng)元和心肌細(xì)胞系分化
使用已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)方案，首先將細(xì)胞分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞，然后再分化為神經(jīng)干細(xì)胞。在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代4次后，細(xì)胞分化形成均勻墊狀物（9A），有重復(fù)玫瑰花結(jié)圖案（9C），這是神經(jīng)干細(xì)胞分化階段的特征。其中許多細(xì)胞是OTX2+，更多細(xì)胞同時表達(dá)Pax6和Nestin。
繼續(xù)將干細(xì)胞分化為假定的運動神經(jīng)元前體。根據(jù)分化方案改變小分子和生長因子（圖10，上部），部分細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)OTX2和Nestin，而許多細(xì)胞開始表達(dá)運動神經(jīng)元細(xì)胞系標(biāo)志物Olig2。
以此條件培養(yǎng)1周后，加入細(xì)胞因子和小分子，誘導(dǎo)細(xì)胞最終分化為假定的運動神經(jīng)元（圖10，下部）。在最終培養(yǎng)基混合物中培養(yǎng)7天后，細(xì)胞形成細(xì)小的突起網(wǎng)絡(luò)（大部分為神經(jīng)微絲H+，部分保留TUJ1+外觀，少部分為GFAP+膠質(zhì)細(xì)胞）。許多表達(dá)TUJ1的細(xì)胞也表達(dá)運動神經(jīng)元典型標(biāo)志物，如HB9和Islet-1（數(shù)據(jù)未顯示）。
結(jié)果清楚表明，低氧培養(yǎng)可用于分化形成神經(jīng)外胚層細(xì)胞系。
此外，我們先使用Wnt途徑激活劑CHIR99021通過優(yōu)化的兩步程序?qū)⒓?xì)胞分化為定形內(nèi)胚層，然后使用wntC-59抑制Wnt，將其分化成心肌細(xì)胞。
培養(yǎng)10–11天后，雖然許多細(xì)胞因缺乏胰島素而死亡，但存活的細(xì)胞形成了小斑塊和團塊。這些“節(jié)點”呈三維結(jié)構(gòu)，表達(dá)肌鈣蛋白T、Nkx2.5和平滑肌動蛋白（SMA）。
此外，我們還觀察到了肌鈣蛋白T以及GATA4和MHCv的穩(wěn)定表達(dá)。所有這些表明心肌細(xì)胞系可在低氧環(huán)境中發(fā)育。
綜上，我們在CellXpert®C170i CO2培養(yǎng)箱中以低氧濃度（5%）條件成功實現(xiàn)人包皮成纖維細(xì)胞重編程。
PM1eP5-ERCv2 iPSC細(xì)胞系核型正常，表達(dá)多能性標(biāo)志物Oct4+/SSEA4+（但不表達(dá)SSEA1−）和Nanog+/Lin28+/Tra-1-60+。
此外，在低氧環(huán)境下，iPS細(xì)胞可分化為不同外胚層細(xì)胞、神經(jīng)元干細(xì)胞、運動神經(jīng)元前體，最終分化為運動神經(jīng)元。通過使用標(biāo)準(zhǔn)方案，在培養(yǎng)箱內(nèi)以低氧環(huán)境可將iPSC細(xì)胞系分化為由內(nèi)胚層產(chǎn)生的心肌細(xì)胞。
